薏苡仁提取物体外对肾癌细胞系放射敏感性的影响及作用机制探讨
作者：王俊杰,俞莉章,申文江,刘漓波,李亚钢,汪春林
单位：王俊杰，申文江，李亚钢，汪春林 北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心；刘漓波，俞莉章 北京医科大学第一医院泌尿外科研究所
关键词：康莱特；肾癌细胞；放射敏感性；细胞凋亡；bcl-2；PCNA
癌症990616
【摘要】目的：探讨康莱特(KLT)对肾癌细胞系(GRC-1)的放射增敏作用和机制。材料和方法：利用细胞克隆技术进行剂量-存活曲线分析，末端脱氧核苷酰转移酶法检测细胞凋亡，免疫细胞化学法分析bcl-2和PCNA基因表达。结果：0.2mg/ml KLT组D0值为90.44 cGy，空白对照组和空白乳组D0值分别为131.09 cGy和139.40 cGy,统计学处理P<0.05。0.2mg/ml KLT处理GRC-1细胞后，M1区阳性细胞为89.76%,空白乳组为1.02%。0.2mg/ml KLT组GRC-1细胞bcl-2和PCNA基因表达的标记指数(LI)分别为6.60%和15.2%,空白乳组LI分别为25%和0%,统计学处理差异显著(P<0.01)。结论：0.2mg/ml KLT具有明显提高GRC-1细胞放射敏感性的作用，其作用机制是诱发GRC-1细胞凋亡,抑制GRC-1细胞bcl-2基因表达和上调PCNA基因表达。
, http://www.100md.com
中图分类号：R73-36 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0680-03
The study of the influence of Kang-Lai-Te injection on radiosensitivity of renal carcinoma cell lines and its mechanism
WANG Jun-jie,YU Li-zhang,SHEN Wen-jiang,et al.
The First Teaching Hospital of Beijing Medical University,Beijing 100034,P.R.China
【Abstract】 Objective：To investigate the influence of Kang-Lai-Te injection (KLT) on radiosonsitivity of renal carcinoma cell lines(GRC-1) after ionizing irradiation and its mechanism.Materals and Methods：Exposed to lipase 10ul/ml and 0.2 mg/ml KLT respectively for 48h，the colony formation ability of GRC-1 cells after 10mv Xray irradiation was analysed by Linear-quadratic formulation.The apoptotic percentages of GRC-1 cell lines were measured by TUNEL.The expression of bcl-2 and PCNA genes were detected by immunohistochemistry assay.Results：The D0 values of GRC-1 cell lines were 90.44 cGy，and those of control group and lipase group were 131.09 cGy and 139.40 cGy respectively(P<0.05)，there were no significant difference between the values of lipase and control group.The apoptotic percentages of GRC-1 cell lines exposed to KLT and lipase group were 89.76% and 1.02% respectively.The LI of KLT and lipase group were 6.60% and 25% respective (P<0.01).Conclusion：KLT could increase radiosensitivity of GRC-1 cell lines， induce GRC-1 cell apoptosis，down-regulate expression of bcl-2 gene and up-regulate expression of PCNA.
, 百拇医药
Key words：KLT;Renal carcinoma cell lines;Radiosensitivity;Apoptosis;bcl-2; PCNA
康莱特注射液(KLT)系从中药薏苡仁提取的抗肿瘤制剂，药效学和临床应用表明对多种肿瘤具有明显的抑制作用〔1〕。KLT可以使肿瘤细胞周期再分布，G2+M期比例升高，S期比例下降〔2〕。肾癌是临床放射治疗不敏感的肿瘤，我们利用KLT对肾癌细胞的放射敏感性作用进行了研究，以期提高辐射线对肾癌细胞的杀伤作用。
1材料和方法
1.1药物与细胞培养
国产KLT(10%，批号Z-108)和空白乳剂由康莱特药业有限公司提供。人肾颗粒细胞癌细胞系(GRC-1)由北京医科大学第一医院泌尿外科研究所提供，培养基为RPMI-1640，含15%小牛血清，常规传代培养。A Complete Flow Cytometry Kit(TUNEL)购自美国PharMin-gen公司。
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流式细胞仪：FACScan(Becton Dickson，U.S.A)，北京医科大学第一医院检验科提供。
1.2放射敏感性实验分组
实验分为空白对照组、空白乳剂加照射组和KLT加照射组，细胞生长指数期时，分别加KLT0.2mg/ml和空白乳剂10μl/ml，继续培养48小时，消化细胞制成单细胞悬液，分装在2ml培养瓶中，分别接受不同剂量照射。
照射条件：10MV线直线加速器(美国Varian Clinic18)，剂量率3Gy/分，加2cm等效组织填充物，照射0、2.5、5、7.5和10Gy。照射完毕按浓度梯度法接种24孔培养板培养8天，甲醇固定，姬姆萨染色，计数50个细胞以上克隆数，计算机作“多靶单击模型”的拟合分析。实验结果为2次结果的平均值。
1.3末端脱氧核苷酰转移酶法(TUNEL法)检测细胞凋亡
, 百拇医药
采用APO-DIRECT Kit进行细胞的定量和定性分析〔3〕。细胞接近指数生长期时，更换培养液，其中一瓶加空白乳剂10μl/ml，一瓶加KLT0.2mg/ml。继续培养48小时，常规消化细胞，制成1×106细胞悬液。PBS缓冲液洗二次，5%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗一次，加TUNEL标记混合染液50μl，37℃温浴1小时，PBS洗一次，加碘化丙锭(PI)20μl室温避光反应30分钟，流式细胞仪检测(FACSort)，利用Cell Quest软件处理结果，每次实验均设阴性和阳性对照。
1.4免疫细胞化学分析
采用SPTM法，中山生物技术公司提供SPTM试剂盒，bcl-2单克隆抗体(100)和PCNA单克隆抗体(PC10)。细胞常规培养达指数生长期时分别加空白乳10μl/ml和KLT0.2mg/ml，继续培养48小时，消化细胞湿盒中贴片，继续培养5小时，PBS冲洗2次，冷丙酮固定15分钟，SPTM法染色。同时分别以PBS和正常兔血清代替一抗作空白对照和替代对照。bcl-2基因和PCNA阳性表达分别为细胞浆和核黄褐色染色，选取5个高倍视野(×400)作为观察区，求5个视野内的平均值，bcl-2和PCNA基因阳性表达的标记指数(Labeling Index，LI)根据以下公式计算：
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1.5统计学分析应用SAS软件进行方差分析和秩和检验。
2结果
2.1KLT对GRC-1细胞放射敏感性的影响
由图1可见，KLT组Do值为90.44 cGy，空白对照和空白乳剂组D0值分别为131.09cGy和139.40 cGy，统计学处理KLT可以明显提高GRC-1细胞的放射敏感性(P<0.05)。增敏比分别为1.45和1.54。
图1 不同剂量照射GRC-1细胞后剂量-存活曲线
2.2KLT诱导和GRC-1细胞凋亡的检测
空白乳和KLT处理肾癌细胞后，流式细胞仪分析M1区阳性细胞分别为1.02%和89.76%。方差检验差别非常显著(P<0.01)，表明KLT具有诱发GRC-1细胞凋亡的作用，结果见图2。
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图2 KLT诱发GRC-1细胞凋亡
(2A)阳性对照组 (2B)阴性对照组
(2C)空白乳组 (2D)康莱特组
2.3KLT对GRC-1细胞bcl-2和PCNA基因表达的影响
KLT组bcl-2基因表达减少，PCNA表达升高，秩和检验分析，差异非常显著(P<0.01)，表明有明显下调GRC-1细胞bcl-2基因表达和上调PCNA表达的作用。结果见表1。
表1 0.2mg/ml康莱特对GRC-1细胞bcl-2和PCNA基因表达的影响
基因
LI(%)
, 百拇医药
空白乳组
KLT组
Bcl-2
250
6.6
PCNA
0
15.2
2.4空白乳组和KLT组GRC-1细胞bcl-2基因的表达
KLT组GRC-1细胞bcl-基因表达较空白乳组明显减弱，(见图3A、3B)。
, http://www.100md.com 图3 空白乳组和KLT组GRC-1细胞bcl-2基因表达比较(×400)
3A：空白乳组； 3B：KLT组
2.5空白乳组和KLT组GRC-1细胞PCNA基因的表达
KLT组GRC-1细胞PCNA基因表达较空白乳组明显增加，(见图4A，4B)
图4 空白乳组和KLT组GRC-1细胞PCNA基因表达比较(×400)
4A：空白乳组； 4B：KLT组
3讨论
肾癌是临床上放射治疗非常不敏感的肿瘤，化疗效果也不十分满意，如何提高肾癌的局部控制仍没有理想的治疗方法。
, 百拇医药
基础研究证明〔2〕，KLT可以使细胞周期阻滞于G2+M期，G2+M期是肿瘤放疗最敏感时相，而S期是不敏感时相。我们利用肾癌细胞系经KLT0.2mg/ml处理后48小时照射，结果证明KLT可以明显提高肾癌细胞的放射敏感性，增敏比1.54。
0.2mg/ml KLT可以诱发人大肠癌SW1116细胞凋亡〔1〕。我们研究也发现KLT可以诱发肾癌细胞凋亡，杨宝龙等〔4〕对肾癌细胞10Gy照射后，电泳分析没有发现细胞凋亡的特征DNALadder。Keren等〔5〕研究发现12Gy以下剂量照射时，细胞凋亡数量没有明显增加，射线对肿瘤细胞的抑制作用主要通过抑制细胞克隆形成能力。因此，KLT处理肾癌细胞后，可以直接诱发细胞凋亡，同时也可以使对射线相对抗拒的那部分肾癌细胞(凋亡亚群)转变为相对敏感亚群，进而提高射线对肾癌细胞的杀伤作用。
, http://www.100md.com bcl-2具有阻止细胞发生凋亡的作用。刘承勇等〔8〕研究发现射线诱发脑胶质瘤细胞凋亡与Bcl-2基因下调有关。我们的研究发现，KLT具有下调肾癌细胞Bcl-2基因表达的作用，Bcl-2基因表达减少使肾癌细胞对射线诱发细胞凋亡的作用更加敏感。
PCNA是DNA聚合酶δ的辅助成分，G1期逐渐增多，S期达高峰，G2+M减少，是DNA复制所必须的，参与细胞增殖和修复。Willett〔7〕报道PCNA蛋白的高表达提示肿瘤有较高的增殖活性，对射线作用敏感。本研究发现经KLT处理后肾癌细胞的PCNA蛋白表达明显增加，增加对射线的敏感性。
作者简介：王俊杰 通讯作者：北京医科大学第一医院(北京,100083)
〔参考文献〕
〔1〕李大鹏主编.康莱特抗肿瘤的研究〔M〕.浙江：浙江大学出版社，1998：1.
, 百拇医药
〔2〕李大鹏主编.康莱特抗肿瘤的研究〔M〕.浙江：浙江大学出版社，1998：107.
〔3〕Arends MJ，Morris RG，Wyllie AH.Apoptosis：The role of endonuclease〔J〕.AmJPathol,1990，136：593～608.
〔4〕杨宝龙，顾方六，丁义，等.X射线和苏拉明联合应用诱发肾癌GRC-1细胞凋亡的研究〔J〕.中华泌尿外科杂志，1997，18：518.
〔5〕Hopcia KL，Me Carey YL,SyLuester FC,et al.Radiati-on-induced apoptosis in HL60 cells：oxygen effect，relationship between apoptosis and loss of clonogenicity，and dependence of time to apoptosis on radiationdose〔J〕.Radiat Res,1996，145：315～323.
〔6〕刘承勇，杨开军，任文德，等.p53和Bcl-2表达与BT325细胞辐射性凋亡的关系〔J〕.中华放射医学与防护杂志，1998，12(2)：87.
〔7〕Willett CG，Warland G，Hagan MP，et al.Tumor proliferation in rectal cancer following preoperative irradiation〔J〕.J Clin Oncol 1995;13(6)：1417～1424.
收稿日期：1999-01-05；修回日期：1999-02-14, 百拇医药
单位：王俊杰，申文江，李亚钢，汪春林 北京医科大学第一医院肿瘤治疗中心；刘漓波，俞莉章 北京医科大学第一医院泌尿外科研究所
关键词：康莱特；肾癌细胞；放射敏感性；细胞凋亡；bcl-2；PCNA
癌症990616
【摘要】目的：探讨康莱特(KLT)对肾癌细胞系(GRC-1)的放射增敏作用和机制。材料和方法：利用细胞克隆技术进行剂量-存活曲线分析，末端脱氧核苷酰转移酶法检测细胞凋亡，免疫细胞化学法分析bcl-2和PCNA基因表达。结果：0.2mg/ml KLT组D0值为90.44 cGy，空白对照组和空白乳组D0值分别为131.09 cGy和139.40 cGy,统计学处理P<0.05。0.2mg/ml KLT处理GRC-1细胞后，M1区阳性细胞为89.76%,空白乳组为1.02%。0.2mg/ml KLT组GRC-1细胞bcl-2和PCNA基因表达的标记指数(LI)分别为6.60%和15.2%,空白乳组LI分别为25%和0%,统计学处理差异显著(P<0.01)。结论：0.2mg/ml KLT具有明显提高GRC-1细胞放射敏感性的作用，其作用机制是诱发GRC-1细胞凋亡,抑制GRC-1细胞bcl-2基因表达和上调PCNA基因表达。
, http://www.100md.com
中图分类号：R73-36 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0680-03
The study of the influence of Kang-Lai-Te injection on radiosensitivity of renal carcinoma cell lines and its mechanism
WANG Jun-jie,YU Li-zhang,SHEN Wen-jiang,et al.
The First Teaching Hospital of Beijing Medical University,Beijing 100034,P.R.China
【Abstract】 Objective：To investigate the influence of Kang-Lai-Te injection (KLT) on radiosonsitivity of renal carcinoma cell lines(GRC-1) after ionizing irradiation and its mechanism.Materals and Methods：Exposed to lipase 10ul/ml and 0.2 mg/ml KLT respectively for 48h，the colony formation ability of GRC-1 cells after 10mv Xray irradiation was analysed by Linear-quadratic formulation.The apoptotic percentages of GRC-1 cell lines were measured by TUNEL.The expression of bcl-2 and PCNA genes were detected by immunohistochemistry assay.Results：The D0 values of GRC-1 cell lines were 90.44 cGy，and those of control group and lipase group were 131.09 cGy and 139.40 cGy respectively(P<0.05)，there were no significant difference between the values of lipase and control group.The apoptotic percentages of GRC-1 cell lines exposed to KLT and lipase group were 89.76% and 1.02% respectively.The LI of KLT and lipase group were 6.60% and 25% respective (P<0.01).Conclusion：KLT could increase radiosensitivity of GRC-1 cell lines， induce GRC-1 cell apoptosis，down-regulate expression of bcl-2 gene and up-regulate expression of PCNA.
, 百拇医药
Key words：KLT;Renal carcinoma cell lines;Radiosensitivity;Apoptosis;bcl-2; PCNA
康莱特注射液(KLT)系从中药薏苡仁提取的抗肿瘤制剂，药效学和临床应用表明对多种肿瘤具有明显的抑制作用〔1〕。KLT可以使肿瘤细胞周期再分布，G2+M期比例升高，S期比例下降〔2〕。肾癌是临床放射治疗不敏感的肿瘤，我们利用KLT对肾癌细胞的放射敏感性作用进行了研究，以期提高辐射线对肾癌细胞的杀伤作用。
1材料和方法
1.1药物与细胞培养
国产KLT(10%，批号Z-108)和空白乳剂由康莱特药业有限公司提供。人肾颗粒细胞癌细胞系(GRC-1)由北京医科大学第一医院泌尿外科研究所提供，培养基为RPMI-1640，含15%小牛血清，常规传代培养。A Complete Flow Cytometry Kit(TUNEL)购自美国PharMin-gen公司。
, http://www.100md.com
流式细胞仪：FACScan(Becton Dickson，U.S.A)，北京医科大学第一医院检验科提供。
1.2放射敏感性实验分组
实验分为空白对照组、空白乳剂加照射组和KLT加照射组，细胞生长指数期时，分别加KLT0.2mg/ml和空白乳剂10μl/ml，继续培养48小时，消化细胞制成单细胞悬液，分装在2ml培养瓶中，分别接受不同剂量照射。
照射条件：10MV线直线加速器(美国Varian Clinic18)，剂量率3Gy/分，加2cm等效组织填充物，照射0、2.5、5、7.5和10Gy。照射完毕按浓度梯度法接种24孔培养板培养8天，甲醇固定，姬姆萨染色，计数50个细胞以上克隆数，计算机作“多靶单击模型”的拟合分析。实验结果为2次结果的平均值。
1.3末端脱氧核苷酰转移酶法(TUNEL法)检测细胞凋亡
, 百拇医药
采用APO-DIRECT Kit进行细胞的定量和定性分析〔3〕。细胞接近指数生长期时，更换培养液，其中一瓶加空白乳剂10μl/ml，一瓶加KLT0.2mg/ml。继续培养48小时，常规消化细胞，制成1×106细胞悬液。PBS缓冲液洗二次，5%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗一次，加TUNEL标记混合染液50μl，37℃温浴1小时，PBS洗一次，加碘化丙锭(PI)20μl室温避光反应30分钟，流式细胞仪检测(FACSort)，利用Cell Quest软件处理结果，每次实验均设阴性和阳性对照。
1.4免疫细胞化学分析
采用SPTM法，中山生物技术公司提供SPTM试剂盒，bcl-2单克隆抗体(100)和PCNA单克隆抗体(PC10)。细胞常规培养达指数生长期时分别加空白乳10μl/ml和KLT0.2mg/ml，继续培养48小时，消化细胞湿盒中贴片，继续培养5小时，PBS冲洗2次，冷丙酮固定15分钟，SPTM法染色。同时分别以PBS和正常兔血清代替一抗作空白对照和替代对照。bcl-2基因和PCNA阳性表达分别为细胞浆和核黄褐色染色，选取5个高倍视野(×400)作为观察区，求5个视野内的平均值，bcl-2和PCNA基因阳性表达的标记指数(Labeling Index，LI)根据以下公式计算：
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1.5统计学分析应用SAS软件进行方差分析和秩和检验。
2结果
2.1KLT对GRC-1细胞放射敏感性的影响
由图1可见，KLT组Do值为90.44 cGy，空白对照和空白乳剂组D0值分别为131.09cGy和139.40 cGy，统计学处理KLT可以明显提高GRC-1细胞的放射敏感性(P<0.05)。增敏比分别为1.45和1.54。
图1 不同剂量照射GRC-1细胞后剂量-存活曲线
2.2KLT诱导和GRC-1细胞凋亡的检测
空白乳和KLT处理肾癌细胞后，流式细胞仪分析M1区阳性细胞分别为1.02%和89.76%。方差检验差别非常显著(P<0.01)，表明KLT具有诱发GRC-1细胞凋亡的作用，结果见图2。
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图2 KLT诱发GRC-1细胞凋亡
(2A)阳性对照组 (2B)阴性对照组
(2C)空白乳组 (2D)康莱特组
2.3KLT对GRC-1细胞bcl-2和PCNA基因表达的影响
KLT组bcl-2基因表达减少，PCNA表达升高，秩和检验分析，差异非常显著(P<0.01)，表明有明显下调GRC-1细胞bcl-2基因表达和上调PCNA表达的作用。结果见表1。
表1 0.2mg/ml康莱特对GRC-1细胞bcl-2和PCNA基因表达的影响
基因
LI(%)
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空白乳组
KLT组
Bcl-2
250
6.6
PCNA
0
15.2
2.4空白乳组和KLT组GRC-1细胞bcl-2基因的表达
KLT组GRC-1细胞bcl-基因表达较空白乳组明显减弱，(见图3A、3B)。
, http://www.100md.com 图3 空白乳组和KLT组GRC-1细胞bcl-2基因表达比较(×400)
3A：空白乳组； 3B：KLT组
2.5空白乳组和KLT组GRC-1细胞PCNA基因的表达
KLT组GRC-1细胞PCNA基因表达较空白乳组明显增加，(见图4A，4B)
图4 空白乳组和KLT组GRC-1细胞PCNA基因表达比较(×400)
4A：空白乳组； 4B：KLT组
3讨论
肾癌是临床上放射治疗非常不敏感的肿瘤，化疗效果也不十分满意，如何提高肾癌的局部控制仍没有理想的治疗方法。
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基础研究证明〔2〕，KLT可以使细胞周期阻滞于G2+M期，G2+M期是肿瘤放疗最敏感时相，而S期是不敏感时相。我们利用肾癌细胞系经KLT0.2mg/ml处理后48小时照射，结果证明KLT可以明显提高肾癌细胞的放射敏感性，增敏比1.54。
0.2mg/ml KLT可以诱发人大肠癌SW1116细胞凋亡〔1〕。我们研究也发现KLT可以诱发肾癌细胞凋亡，杨宝龙等〔4〕对肾癌细胞10Gy照射后，电泳分析没有发现细胞凋亡的特征DNALadder。Keren等〔5〕研究发现12Gy以下剂量照射时，细胞凋亡数量没有明显增加，射线对肿瘤细胞的抑制作用主要通过抑制细胞克隆形成能力。因此，KLT处理肾癌细胞后，可以直接诱发细胞凋亡，同时也可以使对射线相对抗拒的那部分肾癌细胞(凋亡亚群)转变为相对敏感亚群，进而提高射线对肾癌细胞的杀伤作用。
, http://www.100md.com bcl-2具有阻止细胞发生凋亡的作用。刘承勇等〔8〕研究发现射线诱发脑胶质瘤细胞凋亡与Bcl-2基因下调有关。我们的研究发现，KLT具有下调肾癌细胞Bcl-2基因表达的作用，Bcl-2基因表达减少使肾癌细胞对射线诱发细胞凋亡的作用更加敏感。
PCNA是DNA聚合酶δ的辅助成分，G1期逐渐增多，S期达高峰，G2+M减少，是DNA复制所必须的，参与细胞增殖和修复。Willett〔7〕报道PCNA蛋白的高表达提示肿瘤有较高的增殖活性，对射线作用敏感。本研究发现经KLT处理后肾癌细胞的PCNA蛋白表达明显增加，增加对射线的敏感性。
作者简介：王俊杰 通讯作者：北京医科大学第一医院(北京,100083)
〔参考文献〕
〔1〕李大鹏主编.康莱特抗肿瘤的研究〔M〕.浙江：浙江大学出版社，1998：1.
, 百拇医药
〔2〕李大鹏主编.康莱特抗肿瘤的研究〔M〕.浙江：浙江大学出版社，1998：107.
〔3〕Arends MJ，Morris RG，Wyllie AH.Apoptosis：The role of endonuclease〔J〕.AmJPathol,1990，136：593～608.
〔4〕杨宝龙，顾方六，丁义，等.X射线和苏拉明联合应用诱发肾癌GRC-1细胞凋亡的研究〔J〕.中华泌尿外科杂志，1997，18：518.
〔5〕Hopcia KL，Me Carey YL,SyLuester FC,et al.Radiati-on-induced apoptosis in HL60 cells：oxygen effect，relationship between apoptosis and loss of clonogenicity，and dependence of time to apoptosis on radiationdose〔J〕.Radiat Res,1996，145：315～323.
〔6〕刘承勇，杨开军，任文德，等.p53和Bcl-2表达与BT325细胞辐射性凋亡的关系〔J〕.中华放射医学与防护杂志，1998，12(2)：87.
〔7〕Willett CG，Warland G，Hagan MP，et al.Tumor proliferation in rectal cancer following preoperative irradiation〔J〕.J Clin Oncol 1995;13(6)：1417～1424.
收稿日期：1999-01-05；修回日期：1999-02-14, 百拇医药